Методи виділення чистих культур анаеробів

Тема: Фізіологія мікроорганізмів. Дихання бактерій. Способи культивування і виділення чистої культури анаеробів.

1.9.Актуальність теми полягає в необхідності отримання знань в способах виділення чистих культур патогенних анаеробних бактерій.

1.10.Цілі вивчення теми.

1.10.1.Мета загальна: Завершити етапи бактеріологічного способу по ідентифікації анаеробних бактерій.

1.10.2.Мета конкретна: Засвоїти методи культивування та виділення чистих культур анаеробних мікроорганізмів.

1. Вивчити методи культивування анаеробів.

2. Ознайомитись з апаратурою, яка застосовується для культивування анаеробів.

3. Засвоїти методи виділення чистих культур анаеробів.

1.11.Забезпечення вихідного рівня знань – разумінь.

7. Знати типи дихання мікроорганізмів.

8. Вміти засівати мікроорганізми в різні поживні середовища.

1.11.1.Тести на вихідний рівень знань – разумінь.

Які субстрати введено в маленький “строкатий” ряд Гісса?

B. Лакмусове молоко.

D. МПБ з індикаторними папірцями на індол та сірководень.

1.12.1.Граф логічні структури змісту.

Вивчення морфології та тінкторіальних властивостей спорових форм мікроорганізмів шляхом мікроскопії фарбованого за способом Грама продукту.

Ознайомлення з живильними середовищами для культивування анаеробів (Кітта – Тароцці, Вільсон – Блера, напіврідкий цукровий агар високим стовпчиком).

Ознайомлення з апаратурою для вирощування анаеробних мікроорганізмів.

1.12.2.Перелік теоретичних питань.

Класифікація мікрорганізмів за типом дихання. Сутність процесу дихання у мікроорганізмів. Принципи культивування анаеробів. Етапи виділення чистих культур спорових та неспорових анаеробів.

1.12.3.Джерела навчальної інформації.

1. К.Д. Пяткін, Ю.С.Кривошеїн. – Мікробіологія. – К., 1992 (укр.) – С. 56-59.

2. К.Д. Пяткин, Ю.С.Кривошеин. – Микробиология. – М. – М. – 1980 (рос.) – С. 59-64

3. К.Д. Пяткин, Ю.С.Кривошеин. – Микробиология. – М., 1981 (рос.) – С. 59-64

4. А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. – Мед микробиология, иммунология и вирусология. – Санкт-Петербург., 2002 (рос.) – С. 66-72.

5. И.Л. Одичавший, И.Д. Холупяк, Н.Е. Шевелева, М.Ю. Стегний. – Микробиология. – Харьков, 1999 (рос.) – С. 57-58.

6. И.Л. Одичавший, И.Д. Холупяк. – Управление к лабораторным занятиям. – К., 2004 (рос.), С. 113-122.

7. О.І. Климнюк, І.О. Ситник, М.С. Творчо, В.П. Шаробков. – Удобна мікробіологія. – Терн., 2004 (укр.) – С.71-75

8. Л.Б. Борисов. – Управление к практическим занятиям по микробиологии. – М.,1984(рос.) – С. 52-56.

9. М.Н. Лебедева. – Управление к практическим занятиям по мед микробиологии. – М., 1973 (рос.) – С. 52-55.

10. Ю.С. Кривошеин. – Управление к практическим занятиям по мед микробиологии. – М., 1980 (рос.) – С. 29-31.

Словник по мікробіології, вірусології, імунології та інфекційним захворюванням. Під ред., проф. Г.К.Палій., К. – 2004.- с.7 – 146.

1.5.Орієнтовна база дії (ООД).

1.5.1. Вивчення морфології та тінкторіальних властивостей спорових форм мікроорганізмів шляхом зафарбування за способом Грама.

1.5.2. Вивчення поживних середовищ для культивування анаеробних мікроорганізмів.

1.5.3. Вивчення росту анаеробних мікроорганізмів на середовищі Кітта – Тароцці, молоці.

1.5.4. Ознайомитись з роботою анаеростата.

1.5.5. Ознайомитись з хімічними та біологічними способами культивування анаеробних мікроорганізмів.

1.7. Короткі методичні вказівки для роботи студентів на лабораторному занятті.

1.7.1. Методика проведення заняття.

Вміти виділити чисту культуру анаеробів з суміші мікроорганізмів.

Опанувати способами культивування і ідентифікації анаеробних мікроорганізмів

Ознайомитись з живильними середовищами та демонстраційними апаратами для культивування анаеробів.

Методи виділення чистих культур анаеробів.

Живильні середовища для анаеробів повинні відповідати таким основним вимогам: 1) задовольняти живильним потребам; 2) забезпечувати швидке зростання мікроорганізмів; 3) бути адекватно скороченими

Посіви з метою виділення анаеробної мікрофлори, як спо-рообразующей (клостридії), так і неспороутворюючих (вейлонелли, бактероїди, пептококки), виробляють в строго анаеробних умовах. Первинні посіви роблять на збагачувальні середовища (тіогліколевую, Китта — Тароцці), потім пересівають на щільні середовища: цукровий кров’яний агар в чашки Петрі, в високий стовпчик цукрового поживного агару або інші середовища для отримання ізольованих колоній. Після інкубації посівів в анаеробних умовах з утворених колоній бактерій готують мазки, фарбують, микроскопируют, а потім пересівають на середовище Кітт — Тароцці і агарові середовища для виділення чистої культури.

При виділенні спороутворюючих анаеробних бактерій (клостридії) початкові посіви прогрівають на водяній бані при температурі 80 ° С протягом 20 хв для знищення вегетативних клітин сторонньої мікрофлори, яка може бути присутнім в досліджуваному матеріалі

24. Ідентифікація мікроорганізмів морфологічна, культуральная серологічна, біологічна, генетична.

Ідентифікація — це визначення систематичного положення, виділення з будь-якого джерела до рівня виду або варіанту.

25. Біохімічний метод ідентифікації: визначення протеолітичних. сахаролитических, липолитических властивостей, виявлення гемолізинів і оксидоредуктаз. Використання автоматичних мікробіологічних аналізаторів.

Цей метод передбачає вивчення ферментативної деградації різних субстратів (вуглеводів, амінокислот і білків, сечовини, перекису водню та ін.) З утворенням проміжних і кінцевих

карбогідрази — Ферменти, які розкладають вуглеводи. Визначаючи карбогідрази, виявляють т.зв. сахаролитические властивості мікробів. З цією метою використовують такі середовища:

а) середовища Гіссен (рідкі і напіврідкі з індикаторами). В якості останніх використовують реактив Андреде, бромтимоловий синій або ВР Про ферментативної активності бактерій судять по зміні кольору середовища і утворення газу;

б) диференційно-діагностичні середовища з лактозою (Ендо, Левіна. Плоскирева і ін.);

в) поліуглеводние середовища (типу Олькеницкого, Кліглера і ін.).

протеази -ферменти, розкладають білки:

а) досліджувана культура може розщеплювати білки субстрату з утворенням пептона, альбумоз, амінокислот. Цей процес йде за рахунок ферментів-протеїназ і пептідаз. Для виявлення зазначених ферментів досліджувану культуру засівають на ряд середовищ: згорнута сироватка, стовпчик желатину (розрідження в позитивних випадках), молочний агар в чашці Петрі (в позитивних випадках навколо колоній з’являються зони помутніння);

б) розщеплення амінокислот мікробами може йти шляхом декарбоксилювання, або шляхом дезамінування. У першому випадку з тією чи іншою амінокислоти утворюються аміни, які виявляються або методом елекрофореза. або по подщелачиванию середовища. Про наявність дезамінази у мікроба судять за освітою аміаку в середовищі як результат процесу дезамінування амінокислоти;

в) розщеплення амінокислоти тріптафана за рахунок дії ферменту тріптафанази супроводжується утворенням індолу. Останній виявляється за допомогою папірці, змоченою щавлевої кислотою і укріпленої під пробкою над живильним середовищем. У положітельнихслучаях папірець червоніє;

г) для виявлення ферментів розщеплення сірковмісних амінокислот (цистин, цистеїн) ставлять проби на H2S, як Продукт розщеплення цих амінокислот десульфуразамі. Наявність H2S виявляється і в середовищі Олькеницкого;

д) для виявлення уреази — ферменту, що розщеплює сечовину, в живильне середовище нейтральної рН додають сечовину і індикатор. В позитивних випадках середовище змінюється колір за рахунок зсуву рН в лужну сторону в зв’язку з утворенням аміаку. ліпази — Ферменти розкладання ліпідів і ліпоїдів. Найчастіше визначають лецитиназу посівом на жовтковий агар. Лецитиназа розщеплює лецитин на фосфохолін і диглицерид. У цих випадках при зростанні колоній навколо них з’являються опалесцентні зони, що відображають лецитиназну активність.

Ферменти-токсини: Гемолизинам — ферменти розщеплення фосфоліпідної мембраниеритроцитів. Вони виявляються посівом культури на кров’яний агар (5-10%). Розрізняють b-гемоліз або повний гемоліз, коли утворюються зони просвітління навколо колоній, а-гемоліз, неповний гемоліз, при наявності зон зеленого кольору навколо колоній. Відсутність гемолізу позначається як д-гемоліз.

цитотоксинів — Ферменти, які надають токсичний ефект на клітини мішені. Наприклад, цитотоксичность токсину анаеробних микрорганизмов визначають на культурі клітин. З цією метою 1 г матеріалу (випорожнення або ін.) Розводять в фосфатному буфері 1:10 маса / об’єм, центрифугують ЗО хв при 4ОООО об / хв. Супернатант фільтрують на фільтрі 2О нм, вносять в монослой культури клітин Маккоя і інкубують при 37 ° С 24-48 годин до досягнення токсичного ефекту.

Імунохімічної визначення продукції токсинів: використовується, як правило, імуноферментний метод визначення багатьох екзотоксинів -діфтерійного, холерного, стафилококкового і ін. Для цього застосовуються тест-системи на основі моноклональних антитіл до певного екзотоксину.

Ппазмокоагулаза — Фермент, згортає плазму крові тварин. Визначають в пробирочную реакції. В1 мл цитратной плазми кролика або людини (цільної або розведеною в 2 і 4 рази фізрозчином) розмішують петлю добової агарної культури мікроба. Суміш інкубують в термостаті при 37 ° С. В позитивних випадках через 2-4 години плазма згортається (з’являється згусток). Лецитиназа — див. Вище.

1. Визначення оксидаз. На фільтрувальну папір, змочену 1% розчином тетраметілпарафенілендіаміна, петлею наносять смуги випробуваної культури. У позитивному випадку з’являється фіолетове забарвлення смуг (протягом 1 хв).

2. визначення каталази. Краплю 3% розчину перекису водню наносять на предметне скло і туди вносять петлю випробуваної культури. У присутності каталази утворюються бульбашки кисню.

3. визначення дегідрази. Про наявність дегідрази судять по редуцирующей здатності мікроба, тобто здатності відновлювати деякі органічні барвники (наприклад, 1% водний розчин метиленової синьки). До стовпчика цукрового агару (донатор водню) додають барвник (акцептор водню) і засівають мікробну культуру уколом. В позитивних випадках зростаючий на такому середовищі мікроб її знебарвлює.

4. Визначення спектру коротко жирних кислот (КЦЖК), Анаеробні мікроорганізми продукують проміжні продукти, що включають коротколанцюгові жирні кислоти і спирти, спектр (профіль) яких різний у різних видів мікроорганізмів і дозволяє проводити ідентифікацію мікроорганізмів до рівня роду. Найбільш часто досліджують оцтову, пропіонова, бутиловий, ізобутиловий валериановую, ізовалеріанову, капронову і изокапроновая кислоти. Для визначення КЦЖК використовують метод газорідинної хроматографії. Ідентифікують такі мікроорганізми як актиноміцети, проліонібактеріі, еубактеріі, біфідобактерії, клостридії.

В останні роки а бактеріологічних лабораторіях застосовуються комерційні тест-системи для швидкої біохімічної ідентифікації (визначення біохімічної активності різних груп мікроорганізмів): наприклад, 2О тестів для ентеробактерій і ЗО тестів для анаеробів. Схема ідентифікації включає наступні етапи:

Колонії —- Приготування —- Внесення —— Інкубація —- Облік (+ -) —- Інтер-

суспензії суспензії 4 години 37 ° С претации

Як матеріал для ідентифікації використовують добре ізольовану колонію на чашці або чисту культуру в пробірці, з якої готують суспензію в концентрації стандарту оптичної щільності N4, потім по 55 мкл суспензії вносять в лунки із середовищами даної тест-системи. Планшета зі стрипами інкубується при 37 ° С 4 години. Облік може здійснюватися автоматично (використовуючи прилад «АТВ») або візуально Результат біохімічної реакції оцінюють у вигляді «+» або «-» і вносять про референс-таблицю, в якій позитивного результату відповідає чисельне вираження, в результаті чого виходить певний числовий профіль, відповідний спеціапьно розробленим індексом аналітичного профілю, що дозволяє швидко ідентифікувати той ипи інший

Кафедра мікробіології, вірусології та імунології методичнірекомендаці ї

Кафедра мікробіології, вірусології та імунології методичнірекомендаці ї

Заняття 11.

Тема. Фізіологія мікроорганізмів. Методи культивування та виділення чистих культур анаеробів.

2. Середовища для культивування анаеробів.

3. Методи культивування анаеробних бактерій.

4. Методи виділення чистих культур анаеробів.

Протокол заняття: Записати умови, середовища та методи культивування анаеробів (завдання 1, 2). Скласти схеми виділення чистих культур анаеробів (завдання 3).

Навчальні цілі. Вивчити генетичні структури бактерій, їх участь у передачі генетичного матеріалу. Ознайомитись з явищем бактеріофагії. Вивчити властивості бактеріофага, етапи його взаємодії з клітиною, практичне застосування бактеріофага.

7.Фагодіагностика, фаготерапія, фагопрофілактика.

Вірулентний бактеріофаг має наступну дію:

А. Викликає деградацію клітин людини

Завдання 4. Застосування бактеріофага для діагностики. Фаготипування.

Навчальні цілі заняття: Засвоїти відомості про ефективність впливу фізичних та хімічних факторів довкілля, про методи стерилізації та дезінфекції. Знати визначення: „асептика», „антисептика», „стерилізація», „дезінфекція», „дератизація». Вміти вибрати прилади, засоби для знешкодження мікроорганізмів на різних об’єктах. Знати, як провести контроль за ефективністю стерилізації та дезинфекції.

Протокол заняття: Описати хід роботи та замалювати мікро­скопічну картину препаратів (завдання 2). Скласти та записати таблиці (завдання 3, 4).

Навчальні цілі заняття: Засвоїти відомості про роль мікро­організмів у виникненні та розвитку інфекційного процесу. Вивчити методи виявлення факторів вірулентності, токсигенності, агресивності. Ознайоми­тись з класифікацією та властивостями токсинів.

Записи созданы 25534

Похожие записи

Начните вводить, то что вы ищите выше и нажмите кнопку Enter для поиска. Нажмите кнопку ESC для отмены.

Вернуться наверх